Павлова И.Б. 1 Юдина Т.Г. 1 Баскова И.П. 1 Даньян Г.Г. 2 Лейли Ч.Ч. 3 Феоктистова Н.А. 4 Васильев Д.А.
4 Золотухин С.Н. 4
1 ФГБОУ ВПО «Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова»
2 Китайский государственный НИИ пищевой и ферментативной промышленности
3 Шаньдунская академия сельскохозяйственных наук Китая
4 ФГБОУ ВО «Ульяновская ГСХА им. П.А.
Столыпина»
Установлено in vitro, что бактерии Pseudomonas аeruginosa и дрожжи Candida guillermondii, способные вызывать у людей и животных заболевания псевдомонозы и кандидозы, соответственно, чувствительны к антимикробному действию растворов секрета слюнных клеток медицинской пиявки Hirudo medicinalis, а также водного экстракта из разрешённого к клиническому применению препарата «Пиявит». С помощью электронной микроскопии определены основные стадии лизиса микробных клеток под влиянием изучаемых растворов. Симбионт медицинских пиявок – бактерия Aeromonas hydrophila, практически нечувствительна к влиянию растворов как секрета слюнных клеток своего хозяина, так и препарата «Пиявит». Сделан вывод о перспективности использования изучаемых природных антимикробных комплексов, не вызывающих резистентности у микроорганизмов, для лечения заболеваний вместо традиционно используемых антибиотиков.
Ферма пиявок!
гирудотерапия (ГТ); медицинская пиявка (МП); секрет слюнных клеток (ССК); антимикробные белки и пептиды (AMP); псевдомоноз; кандидоз; сканирующая электронная микроскопия (СЭМ); трансмиссионная электронная микроскопия (ТЭМ); дестабилаза-лизоцим (Д-Л); Pseu
1. Баскова И.П. Научные основы гирудотерапии. Гуморальное звено. – Тула, «Аквариус», 2015. — 228 с.
2. Го Даньян. Сравнение антибиотического действия секрета слюнных клеток медицинской пиявки и фермента дестабилазы-лизоцима, входящего в состав этого секрета. / Го Даньян, И.Б. Павлова // Медицинский академический журнал. – 2012. – №5. — С. 485 – 486.
3. Камзолкина О.В. Биология грибной клетки / О.В. Камзолкина, Я.Е. Дунаевский. — Москва: Товарищество научных изданий КМК, 2015. – 239 с.
4. Нетрусов А.И. Практикум по микробиологии: учебн. пособие для студ. вузов. — М., Издат. центр «Академия», 2005. — С. 83 – 376.
5. Окороченков С.А. Антимикробные пептиды: механизмы действия и перспективы практического применения / С.А. Окороченков, Г.А. Желтухина, В.Е. Небольсин // Биомедицинская химия. – 2012. — Т.58, вып.
2. — C. 131-143.
6. Павлова И.Б. Лизис клеток возбудителя псевдомонозов Pseudomonas aeruginona под влиянием секрета слюнных клеток медицинской пиявки Hirudo medicinalis / И.Б. Павлова, Т.Г. Юдина, И.П. Баскова [и др.] // Ветеринарная медицина и продовольственная безопасность: материалы Международного форума.
9-11 июня. — Ульяновск, 2015. — С. 62 – 68.
7. Юдина Т.Г. Антимикробное действие секрета слюнных клеток медицинской пиявки, рекомбинантного дестабилазы-лизоцима и его мутантных форм / Т.Г. Юдина, Г. Даньян., И.Б. Павлова // Материалы Международной Конференции Ассоциации гирудологов. 1 – 5 октября. — Харьков, 2012. — С. 59-60.
8. Fich F. Candida Parapsilosis and Candida Guillermondii / F. Fich, A. Abarzúa-Araya, М. Pérez [et al.] // Emerging Pathogens in Nail Candidiasis. Indian J Dermatol. 2014 Jan-Feb. — № 59(1). – Р. 24–29. DOI: 10.4103/0019-5154.123485 PMCID: PMC3884923
9. Gruenheid S, Le Moual H. Resistance to antimicrobial peptides in Gram-negative bacteria / S. Gruenheid, H. Le Moual // FEMS Microbiol Lett. 2012 May. — № 330(2). – Р. 81-89.
10. Sessa R. Infectious burden and atherosclerosis / R. Sessa R, M. D. Pietro, S. Filardo [et al.] // A clinical issue. World J Clin Cases. – 2014. — № 2(7). – Р. 240-249.
В последние годы антибиотикорезистентность микроорганизмов стала актуальной проблемой мирового значения. Всемирная Организация Здравоохранения (ВОЗ) работает в тесном сотрудничестве с Всемирной организацией по охране здоровья животных (МЭБ), Продовольственной и сельскохозяйственной организацией ООН (ФАО) над усовершенствованием методов борьбы с резистентностью к противомикробным препаратам, в том числе – над оптимальным использованием антибиотиков. ВОЗ разработала проект глобального плана действий по борьбе с устойчивостью микроорганизмов к противомикробным средствам [9].
В связи с этим всё более интенсивно изучают антимикробные белки и пептиды (АМР), которые рассматривают, как альтернативу традиционно используемым антибиотикам. Многие из АМР являются важнейшим звеном врождённого иммунитета макроорганизмов.
Поэтому в процессе коэволюции бактериальных патогенов и их хозяев у ряда микробов выработалась способность противодействовать некоторым АМР. Один из перспективных подходов для преодоления такого противодействия — использование в качестве лекарственных средств не одного, а сразу нескольких АМР, что значительно уменьшает вероятность развития резистентности.
В связи с этим расширяются исследования антимикробной активности природных комплексов, содержащих АМР. Одним из таких комплексов является секрет слюнных клеток медицинской пиявки Hirudo medicinalis (ССК МП), основной гуморальный агент, обеспечивающий высокую эффективность лечения пиявками – гирудотерапии (ГТ).
ГТ оказывает многофакторное антикоагулирующее, тромболитическое, противоишемическое, антимикробное, иммуностимулирующее, восстанавливающее микроциркуляцию действие, и ряд других эффектов. Установлено, что в состав ССК МП входит более сотни белков (ферменты, ингибиторы протеиназ, модуляторы, АМР, а также ещё не описанные белки и пептиды) и более 150 низкомолекулярных соединений. Одним из важных и достаточно хорошо изученных компонентов ССК является АМР дестабилаза-лизоцим (Д-Л). Причём, в ССК обычно содержится несколько изоформ Д-Л, лизоцимы других типов, другие литические ферменты. Получены также данные о множестве новых белков в составе ССК [1, 5]
Проведённое нами ранее сравнение антимикробной активности растворов рекомбинантного Д-Л и ССК МП показало более высокую активность последнего, а также более широкий спектр его антимикробного действия [1, 7]. Такие работы имеют большую значимость и в связи с доказанной ролью многих микроорганизмов в развитии атеросклероза сосудов [10].
Исследования антимикробной активности ССК МП, проведённые на первом этапе in vitro, актуальны для получения конкретных данных о влиянии ССК на микроорганизмы, играющие ключевую роль при развитии ряда заболеваний, они необходимы для лечения этих заболеваний с привлечением ГТ. Кроме того, важно сравнительное изучение антимикробного эффекта растворов ССК и водного экстракта из орального лекарственного препарата «Пиявит», который разрешён к клиническому применению с 1994 г. Этот препарат на основе МП содержит все компоненты ССК, практически полностью сохраняющие свои активности при продолжительном хранении. В настоящее время регистрационный номер «Пиявита» P N000363/02 от 22.05.2008. Производится этот препарат ООО Научно-внедренческой фирмой «Гируд И.Н.», в г. Балаково Саратовской области [1].
В качестве тест-микроорганизмов при изучении антимикробной активности растворов ССК МП и водного экстракта «Пиявита» мы использовали условно-патогенных представителей грибов и бактерий — Candida guillermondii и Pseudomonas aeruginosa, а также бактерию Aeromonas hydrophila . Инвазивные штаммы синегнойной палочки вызывают инфекционные заболевания – псевдомонозы (аэромонозы), а также часто осложняют многие патологические процессы инфекционной и неинфекционной этиологии. Ряд представителей р. Aeromonas признаны факультативными патогенами для людей с ослабленным иммунитетом. Бактерия Aeromonas hydrophila subsp. hydrophila известна, как симбионт медицинской пиявки. Грамотрицательные бактерии Aeromonas spp. и Pseudomonas spp. имеют много сходных признаков, в том числе, у них выявлена широкая резистентность к антибиотикам, тяжёлым металлам, и др. Для некоторых грамотрицательных бактерий установлена резистентность и к AMP [6].
Представители р. Candida являются наиболее распространенными грибными патогенами, способными вызывать серьезные системные заболевания у людей с ослабленным иммунитетом, перенёсших операции, принимающих антибиотики широкого спектра действия. Около половины таких заболеваний вызывает Candida albicans, однако, растёт распространенность заболеваний, вызываемых и другими представителями этого рода. Например, среди возбудителей онихомикоза всё чаще встречается и C. guillermondii [8].
Поэтому изучение чувствительности P. aeruginosa и A. hydrophila, а также C. guillermondii к антибиотическому действию ССК МП и лекарственного препарата «Пиявит», содержащих комплексы AMP, является весьма актуальной задачей.
Цель исследования
Целью настоящей работы явилось изучение in vitro антибиотического влияния на микроорганизмы растворов ССК МП и водного экстракта из орального лекарственного препарата «Пиявит».
1) определить величину антибиотического действия растворов ССК МП и водного экстракта «Пиявита» на условно патогенные микроорганизмы с помощью метода диффузии в агар и контроля жизнеспособности клеток после воздействия на них изучаемых антимикробных агентов;
2) исследовать с помощью СЭМ и ТЭМ картину лизиса микробных клеток, чувствительных к влиянию растворов ССК МП и водного экстракта «Пиявита».
Материал и методы исследования
Отбирали нативный, свободный от примесей, ССК от МП H. medicinalis ранее описанным методом, для чего использовали по 20 особей МП, выращенных на биофабрике и купленных в аптеке. Для получения водного экстракта из препарата «Пиявит» суспензию (без капсул) этого препарата хорошо перемешивали, настаивали 3 часа в стерильной дистиллированной воде при комнатной температуре, затем центрифугировали при 11 тыс. об./мин. в течение 15 мин., использовали супернатант. Концентрацию белка в растворах определяли по известному методу Брэдфорд.
Работу проводили с культурами P.aeruginosa шт. 47, C. guillermondii шт. 327 из Музея культур кафедры микробиологии МГУ им. М.В. Ломоносова (MDMSU), а также A. hydrophila subsp. hydrophila шт. 8 из Музея культур Научно- исследовательского инновационного центра микробиологии и биотехнологии ФГБОУ ВО «Ульяновская ГСХА им.
П.А. Столыпина».
Бактерий выращивали при 37о С в течение суток на агаризованной питательной среде следующего состава: K2HPO4 – 7,0; KH2PO4 – 2,0; цитрат натрия — 0,4; MgSO4 — 0,05; (NH4)2SO4 – 1,0; H2O дист.; pH 7,1. К среде добавляли 10 г/л триптозного бульона и 10 г/л глюкозы; а также 15 г/л высокоочищенного агара («Sigma, или «Difco», США). Дрожжи выращивали на агаризованной среде Чапека.
На этих же средах определяли антимикробную активность изучаемых растворов с известной концентрацией белков методом диффузии в агар, учитывая размер зоны подавления роста тест-культуры от конца лунки. Минимальную ингибирующую концентрацию (МИК) растворов определяли путем учета антибиотических активностей ряда разведений.
МИК выражали в мкг/мл раствора белка, внесенного в лунку. Жизнеспособность микроорганизмов определяли известным способом путём подсчёта колоний, выросших из сохранивших жизнеспособность клеток после влияния на них изучаемых растворов [4].
Статистическую обработку полученных результатов проводили с использованием программ Microsoft Excel; достоверность различий p
Подготовку тест-микроорганизмов для электронной микроскопии проводили общепринятыми методами [4]. Для исследования в просвечивающем (трансмиссионном) электронном микроскопе (ТЭМ) клетки тест-микроорганизмов (контрольные и лизирующиеся под влиянием изучаемых растворов) фиксировали 2 ч. в 0,1 М фосфатном буферном растворе, рН 7,2 с 2,5%-ным глутаровым альдегидом.
Затем образцы отмывали 2 раза в этом же буфере и помещали на 3 ч. в 1%-ный раствор OsO4. После этого препараты отмывали 3 раза в 50%-ном этаноле (пока раствор не становился прозрачным). Образцы оставляли на ночь при 4ºС в 2%-ном растворе уранилацетата в 70%-ном этаноле.
Проводку в спиртах заканчивали: в 80%-ном – 2 раза по 30 мин.; в 96%-ном – 1 раз 1ч.; в абсолютном спирте (100%-ном) – 1 ч. Затем обезвоживание проводили в абсолютном ацетоне – 2 раза по 30 мин. Заливку и пропитку препаратов в эпоне проводили общепринятым способом. Срезы на формваровых пленках просматривали в ТЭМ Geol 1011, (Япония) при ускоряющем напряжении 80 kV после их контрастирования уранилацетатом и реактивом Рейнольса.
Для приготовления бактериальных препаратов методом негативного контрастирования каплю суспензии клеток P.aeruginosa после их инкубации с исследуемыми растворами (в которых определена концентрация белка), а также суспензию — контроль наносили на сеточки с формваровыми пленками. Через одну минуту избыток жидкости удаляли фильтровальной бумагой. Затем наносили на сеточки каплю 2%-ного раствора фосфовольфрамовой кислоты. Через 1 мин избыток жидкости удаляли.
Препараты клеток, приготовленные этими разными способами, просматривали в трансмиссионном микроскопе Geol JEM 1011 (Япония) при ускоряющем напряжении 80 кВ, с помощью Erlangshen ES 500 W Model 782, gatan, с программой Gatan Digital Micrograph.
Для изучения в сканирующем электронном микроскопе (СЭМ) фиксацию контрольных и опытных клеточных суспензий проводили 2,5%-ным глутаровым альдегидом в течение 1 ч; после чего исследуемый материал обезвоживали в спиртах возрастающих концентраций (20%, 50%, 70% — по 30 минут, 96% — 1 час, абсолютный спирт – 1 час), а затем в абсолютном ацетоне 1 час, и высушивали в критической точке. Напыление образцов проводили платиной на приборе фирмы LKB (Швеция). Форму и поверхность исследуемого материала изучали с помощью микроскопов «JSM-6380» (Япония) и «CamScan» (Великобритания) при ускоряющем напряжении 20 кV.
Результаты исследования и их обсуждение
Ранее мы сообщили [6, 7], что бактерии A. hydrophila – симбионты кишечника H. medicinalis, оказались практически устойчивы к влиянию раствора ССК МП в используемых концентрациях (до 100 мкг/мл). Основной причиной такой устойчивости является, по-видимому, эволюционная приспособленность бактерий-симбионтов к обитанию в организме своего хозяина – МП. В настоящем исследовании мы определили влияние на этих бактерий растворов ССК и водного экстракта «Пиявита»: они проявили слабую (следы) антимикробную активность в концентрации 150 мкг/мл. Как известно, биологическая активность разных партий ССК и «Пиявита» может существенно отличаться [1, 6].
Клетки P. aeruginosa чувствительны к антибиотической активности ССК, как мы определили ранее [6]. Эти клетки лизируются и под влиянием раствора водного экстракта «Пиявита». На рис. 1 представлена картина лизиса бактерий P. aeruginosa под влиянием 35 мкг/мл (при 37о С, через 10 мин.) растворов ССК (рис. 1, б) и водного экстракта «Пиявита» (рис. 1, в).
Видно, что, по сравнению с контролем (рис. 1, а), у бактерий нарушена целостность клеточной стенки и мембран. Эти клетки уже через 10 мин. лизируются под влиянием раствора ССК (рис.
1, б), хотя под влиянием раствора водного экстракта «Пиявита» за это время только незначительная часть клеток лизировалась, а у большинства клеток появились признаки изменения морфологии, увеличилось число мембранных везикул (рис. 1, в). Картина практически полного лизиса бактериальных клеток представлена на рис. 1, г.
Рис. 1. Вид в ТЭМ контрастированных клеток P. аeruginosa, лизирующихся под влиянием растворов ССК МП и водного экстракта «Пиявита» (50 мкг/мл, 37о С, через 10 мин.): а) – контроль; б) – лизирующаяся под влиянием ССК клетка с нарушенной целостностью клеточной стенки и мембран; в) клетка с изменённой поверхностью, увеличенным числом мембранных везикул в результате влияния раствора водного экстракта «Пиявита»; г) остатки лизировавшихся под влиянием ССК клеток.
Определение в двух разных опытах жизнеспособности клеток бактерий после действия на них изучаемых растворов одинаковой концентрации (50 мкг/мл, при 37о С) привело к результатам, представленным в табл. 1.
Выживаемость клеток Pseudomonas aeruginosa после действия на них растворов ССК МП и водного экстракта «Пиявита»
Время действия изучаемых растворов на клетки, мин.
% выросших колоний P. аeruginosa (по сравнению с контролем) после действия на бактериальные клетки растворов
(в концентрации 50 мкг/мл):
Водного экстракта «Пиявита»
Источник: science-education.ru
Бизнес на пиявках
Бизнес на пиявках – оригинальная идея бизнеса. Современная индустрия красоты и здоровья активно использует лечебные свойства пиявок.Эти процедуры носят общее название гирудотерапии.
Эти маленькие, полезные кровососущие в нашей стране носят гордое имя официальных лекарственных средств, а их разведение в соответствии с законодательством относится к фармацевтическому производству. Если ваши амбиции бизнесмена шире рамок малой хозяйственной единицы, смело получайте лицензию, необходимую для сбыта питомцев в мед. учреждения. Будьте готовы к соблюдению ряда санитарных условий. Также эта бизнес-идея является интересным способом домашнего заработка.
Условия разведения пиявок.
Где содержать пиявок? – вот один из немногих важных вопросов начинающего бизнесмена. Место содержания пиявок следует разделить на сектора в соответствии со стадией развития подопечных. Коконы не могут находиться вместе со взрослыми, готовыми к работе пиявками.
Их содержат в стеклянных банках или аквариумах с объемом фильтрованной воды не менее трех литров при положительной температуре около 25-27 -ми градусов. Кормление пиявок бычьей кровью, приобретенной на мясокомбинате, и очистка среды обитания производится вручную. Не пропускайте момент, когда нужно отсаживать коконы и мальки, чтобы не было путаницы.
Бизнес на пиявках – полезных вампирах привлекателен из-за относительно низкой стоимости основного ресурса – 30 рублей за штуку у проверенных надежных продавцов-партнеров. Перед приобретением обязательно интересуйтесь условиями содержания ваших будущих питомцев, иначе нельзя быть уверенным в положительном медицинском эффекте. В ближайшем водоеме бесплатно вы можете наловить только разносчиков инфекции. Халатность и безответственность здесь крайне неуместна.
Здоровье крови важно для всего организма человека.
Рентабельность выращивания пиявок как бизнеса
Разумно организованное дело даст возможность достаточно быстро достичь положительной рентабельности. Рынок сбыта пиявок постоянно растет. Аптеки, медицинские центры, частные специалисты в области гирудотерапии заинтересованы в качественном товаре. Далеко не все склонны занижать закупочные цены, поэтому ваш доход имеет все шансы превысить расходы.
Одним словом, это перспективное умеренно затратное направление деятельности для реализации собственных способностей в области частного предпринимательства. Конечно, успешный старт без дальнейшего развития превратиться в ничто, но в этом случае для поддержания бизнеса не нужно ни профессиональных знаний, ни постоянно растущих объемов финансирования. Бизнес на пиявках – путь к успеху!
Видео: Видеокурс “Разведение пиявок для начинающих”
Понравилась эта бизнес идея? — Хорошо, поделитесь ссылкой в соц. сетях, расскажите и друзьям — это лучшая благодарность нам! Поставьте свою оценку этой статье — Бизнес на пиявках, проголосуйте за лучшую бизнес идею — это анонимно и всем сразу видно.
Источник: biznes-prost.ru
Бизнес-портал Пути успеха
За всё время я только в одном медицинском центре встретила такую услугу, как гирудотерапия. Тем не менее это очень полезная процедура, хотя не каждый к ней готов. Думается, что действующие медцентры должны обратить внимание на данное направление терапии и взять на вооружение при развитии своего бизнеса.
Лично мне интересно, насколько рентабелен данный вид деятельности и что нужно для его начала, кроме сертифицированного специалиста? И вообще где-нибудь готовят таких специалистов?
Постов: 93
Традиционные методы обновления крови лучше и не такие противные.
Постов: 49
Гирудотерапия очень полезна особенно мужчинам, кровь следует обновлять хотя бы раз в год (у женщин естественно всё происходит каждый месяц), а пиявки пьют только плохую кровь и дают очень лечебный эффект. Если в организме человека всё в порядке, то пиявка даже не будет присасываться к месту прикладывания.
Специалисты, думаю, должны иметь обязательно высшее медицинское образование и специальный сертификат, полученный в специализированном центре.
Бизнес на пиявках совсем не плохой, только надо разбираться в самих пиявках. Подходят только медицинские пиявки (в России есть еще конские (нильские)) с видами:
— аптечная (Краснодарский край, Кавказ);
— лечебная (Украина);
— восточная.
Они имеют 6 полосок на спинке, пятнышки, острую мордочку.
А я читала, что пиявок в мире более 400 видов.
Интересно по какой цене можно купить медицинские пиявки? И где готовят гирудотерапевтов?
Постов: 93
Хотелось бы немного расширить бизнес — сферу сложившегося обсуждения.
Пиявки — это достаточно выгодное дело не только в целях медицинского применения (в плане расширения спектра услуг медицинских центров на открытие направления гирудотерапии), но и в плане их разведения.
Не следует думать, что для медцентров поставляют исключительно отловленные в естественных водоемах медицинские пиявки. На деле существуют и неплохо развиваются пиявочные фермы (встречаются даже их обозначения как биофабрики мед. пиявок). И это довольно прибыльный бизнес.
В среднем цена реализации одной медицинской пиявки составляет от 33 руб. за шт.
Спрос на них отменный, поскольку на деле не так мало центров, которые занимаются гирудотерапией. Ведь с помощью пиявок лечат ожирение, диабеты, гипертонию, сердечную недостаточность, пороки сердца, гепатит, колит, хелецистит, язвы, туберкулез, пневмонию, катаракты и т. д. Список можно продолжать бесконечно.
В ближайшее время эксперты нашего бизнес — портала подготовят материал на тему организации фермы по выращиванию медицинских пиявок.
Постов: 17
Да, пиявки очень полезные. Правда, способствуют излечению от тяжелейших заболеваний.
И природа воздействия пиявки на человеческий организм заключается не только в отборе плохой крови и улучшении кровоснабжения.
Помимо этого, при укусе они запускают в организм человека вещества, которые обезболивают и оказывают противовоспалительное действие, а также снимают отеки, расщепляют жиры, убирают тромбы.
Всем рекомендую пройти эту процедуру.
А Вы не слышали, что с помощью пиявок можно даже порчу снять?
Когда, пиявки присасываются в местах чакр, то восстанавливается биополе человека, улучшается защитная оболочка организма.
Снятие порчи с помощью пиявок это конечно интересно и нетрадиционно, хотя для меня лично не очень убедительно.
Но я хотела отметить один важный момент.
Пиявки не так безобидны как все думают. Они могут нападать на людей и тогда после укуса можно несколько суток кровь не остановить (они выпускают в кровь какой-то фермент, благодаря которому снижается свертываемость крови).
Пиявки ни в коем случае нельзя ставить гипотоникам, беременным, онкобольным и др.
Ставить пиявки должен обязательно врач высшей квалификации, очень опытный.
Хочу добавить, что далеко не каждый решится добровольно поставить себе пиявки. Я лично очень брезгливая, ни за какие не пойду.
Так что при организации бизнеса на пиявках нужно учитывать и процент отказов людей.
Постов: 35
Источник: puti-uspeha.ru